流式细胞术检测细胞凋亡

一、备用试剂
1,结合缓冲液（10x):0.1M HEPES,pH 7.4;1.4M NaCl;25m M CaCl2,稀释到1x工作液备用；
2,碘化丙碇Propidium lodide(PI）用PBS稀释到50ug/ml备用，建议与Annexin V-FITC联合使用;
3,7-AAD,推荐与Annexin V-PE或者Annexin V-Biotin联合使用；
4,1xPBS室温存储备用；
二，染色步骤
1,用预冷的PBS洗涤细胞两次，之后用1x的结合缓冲液重悬细胞，调节细胞浓度到1x106Cells/ml;
2,取100ul调节好浓度的细胞悬液到5ml流式管底部；
3,加入Annexin V标记蛋白和相应的核酸染料均需要摸索到合适的使用浓度，商品化试剂盒按照说明书操作。
4,均匀混合，室温避光反应15分钟；（若是用Annexin V-Biotin标记蛋白染色，反应后用1x的结合缓冲液洗涤细胞一次，再加入适合浓度的标记链霉亲和素Streptavidin,再加入合适的核酸染料，室温避光反应15分钟。
5,向流式管中加入400µl 1x的结合缓冲液，重悬后及时上流式细胞仪进行分析。
三，操作注意事项
1,补偿对照管很重要；
2,细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞；
3,细胞浓度与染色用的蛋白量要适合；
4,对不同药物浓度和药物作用时间要进行摸索；
四，仪器
实验所用的流式细胞仪为COULTER EPICS XL。 五，样本要求
1,单个细胞：1-2*106个细胞左右；来源于人、小鼠、大鼠或其他。
2,外周血：EDTA 或肝素抗凝全血，5ml左右；来源于人、小鼠、大鼠或其他。
注意：
1,部分常用荧光探针，如PI等，我公司可免费提供；特殊标记物，如CD抗体等，用户须另行购买，也可委托我公司代购，用户所提供抗体应可与样本发生特异性性识别反应。
2,用用户提供的样品或试剂所致的实验问题由用户负责。
六、流式细胞术检测样品推荐制备方法：
细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备:
（1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。
（2）用4摄氏度预冷的70%冷乙醇固定，4摄氏度条件下保存，至少固定18小时。
(3)调整细胞浓度为106cells／ml，取1ml细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1mlPI染液中，27摄氏度孵育30分钟即可进行流式分析。
(4)PI染液终浓度为50µg/ml,RNase A终浓度为20µg／ml。
八、服务流程